一、PCR中引物的作用
PCR技术的原理是利用碱基互补配对的原则,把体内基因的复制在体外进行,从而得到大量的目的基因。
主要原理如下:
双链DNA分子在临近沸点的温度下加热时便会分离成两条单链的DNA分子,然后DNA聚合酶以单链DNA为模板,并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸(dNTP)合成新的DNA互补链。
此外,DNA聚合酶同样需要一小段双链DNA来启动“引导”新链的合成,因此新合成的DNA链的起点事实上是由加入在反应混合物中的一对寡核苷酸引物在模板DNA两端的退火位点决定的。
在为每一条链均提供一段寡核苷酸引物的情况下,两条单链DNA都可以作为合成新生互补链的模板,因为在PCR反应中所选用的一对引物是按照与扩增区段两端序列彼此互补的原则设计的,因此每一条新生链的合成都是从引物的退火结合位点开始,并沿着相反(5’→3’方向)方向延伸。
如此变性、复性、延伸三个过程反复循环,产生了目的片断的大量克隆。
PCR技术是模仿体内的条件,使基因扩增,所以在扩增体系中需要有DNA聚合酶、一定的pH值的缓冲液、要扩增的目的基因(模板),起始扩增的DNA目的片断的引物,及扩增需要的原料(四种三磷酸脱氧核糖核苷酸),Mg2+,DNA复性、变性及延伸温度与时间等。
二、pcr中引物的作用包括
在PCR技术中,引物的作用是为了使脱氧核苷酸加到模板链上,使新链延长,没有引物,DNA聚合酶是不能将单个的脱氧核苷酸加到模板链上的。
而TaqDNA聚合酶是一种耐高温的DNA聚合酶,是从美国黄石国家公园的一个热泉中的一种耐热细菌中提取的,它的作用就是将脱氧核苷酸加到模板上后,将该脱氧核苷酸与原来的脱氧核苷酸间的磷酸二酯键连在一起,使脱氧核苷酸单链向前延伸,最终形成一个新的双链DNA分子。
三、pcr过程中引物的作用
引物的功能是作为核苷酸聚合的起始点,引导DNA的合成。
能设定循环次数,及控制复制次数。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30~40次之间,循环次数越多,非特异性产物的量亦随之增多。
四、PCR技术中引物是什么
PCR全称为聚合酶链式反应,是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术,前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列,以便根据这一序列合成引物。
DNA的合成前端必须是有一小段序列,接着这段序列合成,而不能凭空合成。它前面这一小段序列就是你所要有设计的引物,也就是“一段已知目的基因的核苷酸序列”,需要根据你的模板链设计,因此,扩增不同的基因需要设计不同的引物。
五、Pcr过程中引物的作用是什么
引物可以做为DNA复制开始时DNA聚合酶的结合位点,在细胞外的条件下,只有通过引物,DNA才可以开始进行复制。引物是已知序列的DNA小片段。
六、pcr过程中引物的作用是什么
PCR的技术的主要步骤及PCR引物设计的一般原则分述如下。
PCR的技术的主要步骤:
1、DNA变性:(90℃-96℃):双链DNA模板在热作用下,氢键断裂,形成单链DNA。
2、退火:(60℃-65℃):系统温度降低,引物与DNA模板结合,形成局部双链。
3、延伸:(70℃-75℃):在Taq酶(在72℃左右,活性最佳)的作用下,以dNTP为原料,从引物的3′端开始以从5′→3′端的方向延伸,合成与模板互补的DNA链。
每一循环经过变性、退火和延伸,DNA含量即增加一倍。
现在有些PCR因为扩增区很短,即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成,因此可以改为两步法,即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行,以减少一次升降温过程,提高了反应速度。
引物设计的基本原则:
1、引物长度:15-30bp,常用为20bp左右。
2、引物碱基:G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列参照。
3、引物内部不应出现互补序列。
4、两个引物之间不应存在互补序列,尤其是避免3 ′端的互补重叠。
5、引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%,引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列,否则易导致非特异性扩增。
6、引物3‘端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,最佳选择是G和C。
7、引物的5 ′端可以修饰。
如附加限制酶位点,引入突变位点,用生物素、荧光物质、地高辛标记,加入其它短序列,包括起始密码子、终止密码子等。
七、pcr中引物的作用是什么
引物是指化学本质为单链DNA、可与待扩增的DNA两侧碱基互补的寡核苷酸片段,其设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段,使其能有效地扩增模板DNA序列。
引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否,具体的设计原则包括:
1、引物长度一般在15-30bp。常用的为18-27bp,因为过长会导致其延伸温度大于74℃,不适于Taq DNA聚合酶进行反应。
2、引物GC含量一般为40%-60%, 45-55%为宜,GC含量过高或过低都不利于引发反应,上下游引物GC含量和Tm值要保持接近,一般Tm值不超过5℃。
3、引物所对应的模板序列的Tm值在55-80℃之间,最好为72℃左右。
4、引物的延伸是从3′端开始的,不能进行任何修饰,且 3’端的碱基一般不用A;引物3’端出现3个以上的连续碱基,如GGG或CCC,或者引物3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。
5、碱基要随机分布,且引物自身和引物之间不能有连续4个碱基的互补。
6、尽量在基因的编码区(CDS序列)上设计引物,限制基因组DNA扩增。
7、使用BLAST检索,确认引物特异性。
八、PCR引物的作用
pcr中引物的作用是作为DNA复制开始时DNA聚合酶的结合位点,在细胞外的条件下,只有通过引物,DNA才可以开始进行复制。
九、pcr中引物的作用 高中
引物(Primer)在聚合作用的起始时,可以刺激合成另一种大分子,并与反应物以共价键形式连接的序列。在核酸化学中,引物是一段短的单链RNA或DNA片段,可结合在核酸链上与之互补的区域,其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点,核酸聚合酶可由其3′端开始合成新的核酸链。体外人工设计的引物被广泛用于聚合酶链反应、测序和探针合成等。
自然中存在有生物的DNA复制引物(RNA引物)和聚合酶链式反应(PCR)中人工合成的引物(通常为DNA引物)。一般所说引物,指DNA引物,以下简称引物。
上游引物:DNA分子两端不一样,因为核苷酸分子不是对称的,5’位有个磷酸,3’位是-OH就是:磷酸端和羟基端。DNA复制总是从5’端到3’端,因为DNA聚合酶只能往3’端加核苷酸。所以谁先复制谁上游,往后的就是下游,上游下游是个相对概念,是某一个序列/碱基相对于另一个序列/碱基而言。上游引物是靠近5’端的,下游引物是靠近3‘端的。
DNA是双链,两个链是反向平行的,DNA聚合酶顺着其中一个链走,这个链就是负链,另一个链是反着一段一段复制的,这个是正链。
十、pcr中引物的作用高中生物
引物是短的寡核苷酸片段,充当DNA复制的起点。因为几乎所有DNA聚合酶都不能从头合成,所以它们需要一个3’-羟基作为DNA合成的起始点。这个3’-羟基由相配的引物提供。
在体内,由于DNA聚合酶的忠实性,不能从头合成DNA,因此只能由RNA聚合酶(称为引物酶)生成,采用RNA引物来延伸,在延伸过程中,RNA引物降解并由DNA取代。
在体外PCR反应中所用到的DNA引物,是根据不同的要求及模板序列设计,然后用化学法人工合成的,与模板形成双链后在DNA聚合酶的作用下就可以继续链的延伸;对于大多数PCR反 应,决定整个反应成功与否的最重要因素是引物的序列和质量。